過去十年中，單細胞技術的出現讓研究人員能夠深入探究和回答那些與人類健康和疾病息息相關的生物系統的更復雜問題。自從單細胞技術在2009年首次亮相以來(1,2)，科學家在免疫學(3,4)、癌癥(5,6)、神經科學(7,8)等研究領域充分利用單細胞RNA測序，并發現了大量信息。單細胞測序的魅力和潛力在于能夠以足夠高的分辨率觀察生物學，從而區分稀有細胞類型、發現新細胞類型，并解析隱藏的異質性。

但是，若問題的答案包含在那些因采樣時間或地點限制而無法獲取的細胞時，您會怎么做？若您能夠克服樣本處理的物流挑戰而獲得新的生物學見解，那將會怎樣？在我們最近舉辦的Xperience 2022活動中，我們很高興與您分享了Chromium單細胞基因表達Flex分析的更多細節，這款新產品能夠解決上述問題，將樣本固定帶到高通量單細胞轉錄組學中，擴大樣本可用性。

樣本固定對單細胞研究的好處

單細胞RNA測序研究的范圍和規模在不斷擴大，研究人員的目標是分析與患者隊列或多個治療條件或時間點相對應的大量樣本。伴隨著這些實驗目標，在樣本采集和處理方面還有一些額外因素需要考慮�；�因表達Flex分析為高通量的批量分析創造了新的可能性，并將實驗范圍擴展到脆弱或瀕死細胞、多個采集點的樣本，以及細胞狀態可能不斷變化的樣本。對于研究人員在嘗試達到新的研究深度時所面臨的眾多挑戰，這種新方法提供了解決方案。

“對于一些需要長距離運輸樣本的項目，細胞或組織可能會因為運輸過程中的物理撞擊或不適當的儲存條件而失去活力。在某些情況下，人們需要保存樣本來實現更靈活的實驗設計；具體而言，它有助于保存在不同實驗條件下或不同時間點采集的樣本，并將它們合并。此外，研究人員可能對特定生物學狀態感興趣，而體外處理可能激活特定通路，導致某些組織中的狀態發生改變�！�(9)

保留脆弱細胞或動態的生物學狀態

在采集點固定樣本后，我們可通過標準的單細胞轉錄組學來鎖定仍難以捉摸的生物學。其他存儲方法可能對脆弱細胞來說效果不佳，而反復凍融等常規方法可能造成細胞損傷。除了存儲，運輸到實驗室進行處理也是對樣本完整性的潛在威脅。由此造成的某些細胞類型丟失或者死亡或瀕死細胞的增加可能會扭曲您的分析結果，從而隱藏樣本的真正異質性。同樣地，涉及到快速變化樣本的研究（比如短時間點的藥物篩選，刺激免疫細胞等）也將受益于高效固定，這種操作可保留動態細胞狀態，讓處理不再緊迫。

將分析擴展到更多樣本

您研究的規模和整體情況可能很適合基因表達Flex分析。在大型實驗中，您可能需要在多個時間點采集或在多個條件下檢測以開展小鼠、細胞系或類器官研究，如果實驗方案要求您一次處理所有樣本，那么這些實驗將難以承受，且耗費體力。在采集細胞時對其進行固定可以減輕這些大規模實驗的壓力，讓您在方便時處理樣本�；蛟S您正在開展一項研究，其中樣本來自不同地區，需要運輸到中心實驗室進行處理。固定能夠鎖定細胞狀態并保留樣本質量以便存儲和運輸，在不影響完整性的前提下將分析擴展到更多樣本。

適應日常的操作

您的實驗室每天是如何運作的？如果您與核心實驗室或中心機構合作，他們的工作時間可能有限，這就限制了接受新鮮樣本的時間。當您的樣本在無法預測的時間采集時，這尤其重要。另一方面，即使是在您自己的實驗室中處理，您也可能會擔心不同用戶或不同時間的一致性。在使用固定RNA-seq后，您可以存儲樣本在單次運行中進行批量處理，從而最大限度地減少變化。

消除安全顧慮

拋開這些圍繞通量以及樣本管理和細胞活力的操作問題，基因表達Flex分析甚至能夠提高研究人員的安全性。如果您的工作涉及到含有感染原或病原體的樣本，那么需要在生物安全三級實驗室中執行單細胞研究的所有操作，這會很不方便。固定能夠消除感染原，為您的實驗室工作帶來更多自由。

熟悉且易用的流程

Chromium單細胞基因表達Flex分析采用多聚甲醛（PFA）固定，在采集點保留樣本的生物學特性，這能夠簡化工作流程，將分析擴展到更多樣本，而不受時間限制。我們用值得信賴的Next GEM技術開發出一種操作方案，過去用過我們Chromium單細胞基因表達分析的用戶都會很熟悉，即使是單細胞轉錄組學新手也很容易上手。

這個強大的工作流程包括經過優化的示范方案，適合不同樣本類型，包括細胞系、原代細胞、含有脆弱細胞的解離組織、新鮮或冷凍組織以及FFPE組織。

如上文所述，細胞或細胞核在采集點固定和透化后，就可以安全地存儲和運輸，而不會影響樣本完整性或下游數據質量。在方便時將樣本與探針組（覆蓋18,000多個基因）雜交，并使用單個樣本流程進行單獨處理，或者使用混樣分析流程在Chromium芯片的單個通道中合并處理多達16個樣本。

這一步的分析流程與我們的3’和5’基因表達方案高度相似，需要在Chromium iX/X儀器上進行單細胞微滴生成。在此過程中，連接探針組并延伸以加入獨特的條形碼，從而保留細胞身份。在構建文庫和測序之后，可以使用10x Genomics的Cell Ranger和Loupe Browser軟件工具進行分析。

Chromium單細胞基因表達Flex分析流程概覽

固定，還是不固定？

與任何新研究一樣，您需要充分考慮您的實驗目標以及這些目標如何影響整體實驗設計，更重要的是，哪些分析可幫助您達成這些目標。對于單細胞基因表達研究，樣本類型、通量能力和特定分析物都會影響這一決策。

物種

單細胞基因表達Flex分析目前與人類和小鼠樣本兼容。對于其他物種，經典的3’或5’單細胞基因表達分析將是最佳選擇。

通量

如果您正在處理大量樣本，并希望對它們進行批量分析或混樣分析，現在有兩個選擇：基因表達Flex分析或單細胞基因表達HT（帶有3’ CellPlex混樣分析）�；�因表達Flex分析通過內置在探針組中的獨特條形碼實現混樣分析，而帶有3’ CellPlex的單細胞基因表達HT分析使用與物種無關的標簽來標記樣本。同樣，在鑒定稀有細胞或深度開發細胞圖譜時，這兩種分析方法都能幫助您最大限度地提高特定樣本的細胞通量。

分析物

多組學分析能夠為單細胞實驗增添驚人的細節，而我們的每種單細胞基因表達分析都提供了同時測定多個分析物的選項。使用單細胞基因表達試劑盒或基因表達Flex分析的單個樣本流程可分析全轉錄組基因表達和細胞表面蛋白表達。（在我們的兼容產品頁面上查找BioLegend的TotalSeq B寡核苷酸偶聯抗體，了解抗體組合的更多信息。）

如果您想獲得其他的多組學信息，下列分析為您提供了探索更多分析物的絕佳機會，但與PFA樣本不兼容。在深入研究免疫學問題時，單細胞免疫分析能夠分析配對的全長B細胞或T細胞受體、表面蛋白表達、抗原特異性和基因表達，所有這些都來自同一個單細胞。我們的單細胞CRISPR篩選分析可幫助您直接評估特定的基因編輯或敲低，以及由此產生的基因表達譜（很快還有細胞表面蛋白）。

創新的工具，全新的見解

隨著研究不斷向前推進以改善人類健康，我們看到新的機會不斷出現，有望克服更大型、更復雜研究的挑戰�；�因表達Flex分析的開發是為了將研究擴大到更多樣本，保留脆弱細胞的生物學狀態，并克服阻礙此類研究取得進展的物流挑戰。隨著單細胞技術有了這些重大進步，科學家們能夠研究影響生理學和病理學的分子變化，讓我們對疾病進展和治療的認知有所改變。

更多信息請參考Chromium單細胞基因表達Flex彩頁

參考文獻：

1.Aldridge S and Teichmann SA.Single cell transcriptomics comes of age. Nat Commun 11: 4307 (2020).
2.Tang F, et al. mRNA-Seqwhole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods 6: 377–382 (2009).
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4.Kim D, et al. Targeted therapyguided by single-cell transcriptomic analysis in drug-induced hypersensitivitysyndrome: a case report. Nat Med 26: 236–243 (2020).
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6.Lynn RC, et al. c-Junoverexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature 576: 293–300 (2019).
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8.De Miguel Z, et al. Exerciseplasma boosts memory and dampens brain inflammation via clusterin. Nature 600: 494–499 (2021).
9.Wang X and Yu L. The effect ofmethanol fixation on single-cell RNA sequencing data. BMC Genomics 22: 420 (2021).